O-Linked Sialoglycans Memengaruhi Pembelahan SARS-CoV-2 spike
Dalam penelitian terbaru yang diposting ke preprint server bioRxiv*, para peneliti dari Spanyol, Inggris, dan Amerika Serikat menggunakan alat kimia untuk mengungkap detail molekuler modulasi yang dimediasi glikan dari sindrom pernapasan akut coronavirus 2 (SARS-CoV-2). pemrosesan spike (S).
Latar belakang
SARS-CoV-2 S adalah glikoprotein multidomain trimerik dengan
lapisan glikan yang padat. polybasic (arginine-rich peptide sequences) furin
cleavage site (FCS) di S (FL-S) full-length meningkatkan pengikatan ke reseptor
sel inang setelah dibelah oleh furin atau transmembrane protease serine 2
(TMPRSS2). Pembelahan proteolitik yang ditingkatkan dari FL-S menjadi subunit
S1 dan S2 telah dikaitkan dengan polimorfisme antara amino acid (AA) /residu
peptida glutamine (Gln)675 dan prolin (Pro)681 sebelum FCS. Khususnya, wilayah
peptida SARS-CoV-2 S ini juga menyimpan banyak residu serin (Ser) dan treonin
(Thr) AA yang mungkin membawa N-acetylgalactosamine (O-GalNAc) glycans. Menurut
penulis, glikosilasi O-GalNAc terkait-Ser/Thr berdampak pada pembelahan S yang
dimediasi furin dan TRMPSS2.
Peregangan AA ini juga paling rentan terhadap mutasi;
selanjutnya, dalam Alpha dan Delta SARS-CoV-2 variants of concern (VOCs),
beberapa mutasi disimpan antara Pro681 hingga histidin (His) dan arginin (Arg),
masing-masing. Di semua sub-lineages keturunan Omicron, termasuk BA.1, BA.2,
dan BA.5, ada mutasi pada P681H dan N679K. Semua mutasi ini memiliki efek
peningkatan pembelahan proteolitik S. Merupakan tantangan analitis untuk
mempelajari regangan peptida ini pada SARS-CoV-2 S karena kompleksitas
biosintetiknya dan kurangnya urutan konsensus peptida. Selain itu, ada
kekurangan data tentang kelimpahan glikan, situs perlekatannya, dan pengaruh
strukturalnya terhadap proteolisis. Selain itu, penelitian hampir tidak
menyelidiki peran mutasi VOC SARS-CoV-2 pada glikosilasi O-GalNAc.
Ada keluarga dari 20 GalNAc transferase, GalNAc-T1 hingga
T20 isoenzim dengan berbagai substrat. Mengidentifikasi situs glikosilasi dari
setiap GalNAc-T dapat memberikan wawasan tentang biologi O-glikan. Dalam
penelitian sebelumnya oleh Ten Hagen et al., mereka menemukan tujuh isoenzim
yang dapat memasukkan GalNAc ke dalam SARS-CoV-2 S.
Tentang studi
Dalam penelitian ini, para peneliti menggunakan taktik
teknik kimia yang disebut " bump-and-hole (BH) engineering“ untuk
mempelajari isoenzim GalNAc-T individu dalam sel hidup. Lebih lanjut, mereka
bersikeras bahwa meningkatkan pengurutan glikopeptida berbasis fragmentasi
dapat memungkinkan analisis mass spectrometry (MS)-based analysis.
Pertama, para peneliti menginkubasi rekombinan S strain wild-type
(WT) SARS-CoV-2 dengan konstruksi P681R (atau P681H) yang diproduksi dalam sel
Expi293-F manusia dengan GalNAc-T1 atau T2 versi WT atau BH. Kemudian, mereka
melanjutkan untuk menabrak konstruksi ini dengan nucleotide-sugar uridine
diphosphate (UDP)-GalN6yne. Mereka menandai versi glikosilasi oleh copper(I)-catalyzed
azide-alkyne cycloaddition (CuAAC) untuk visualisasi melalui Streptavidin blot.
Perawatan ini memperkenalkan GalN6yne dengan cara spesifik isoenzim sambil
memberikan glikopeptida dengan muatan positif tambahan yang memfasilitasi
analisis MS.
a) Model spike dan kartun SARS-CoV-2. Situs pembelahan furin dan penyelarasan peptida untuk varian COVID-19 yang menjadi perhatian dan virus corona terkait. Disorot dengan warna kuning adalah motif polibasik SARS-CoV- 2. Tebal dan merah adalah perubahan asam amino pada posisi 679 dan 681. b) Bump-and-hole engineering memungkinkan penandaan spesifik isoenzim GalNAc-T dari substrat glikosilasi menggunakan tombol yang dapat diklik substrat UDPGalN6yne. FCS = furin cleavage site; VOCs = variants of concern
Kemudian, tim melakukan subunit FL-S dan S1/S2 untuk
pencernaan dalam gel dan menganalisisnya dengan tandem MS (ETD). Mereka
menggunakan high-intensity collision-induced dissociation (HCD) untuk
mendapatkan urutan peptida telanjang dan komposisi glikan dan kemudian
menggunakan ion diagnostik I-tagged-GalN6yne untuk memicu fragmentasi ETD dari
tulang punggung peptida. Para peneliti juga memvalidasi hasil penelitian secara
in vitro. Untuk tujuan ini, mereka menggunakan glikosilasi protein S yang
diekspresikan secara rekombinan dengan versi larut BH-GalNAc-T1 dan
BH-GalNAc-T2 dan CuAAC dengan I-tagged-azide dan analisis glikoproteomik MS.
Tim menggunakan panel peptida sintetis untuk mempelajari
efek mutasi protein S pada glikosilasi yang dimediasi GalNAc-T1. Peptida ini
memiliki mutasi terkait VOC SARS-CoV-2 di hotspot utama: Gln675, Gln677,
asparagine (Asn)679, dan Pro681.
Glikosilasi memodulasi pemrosesan proteolitik S tergantung
pada jarak ke tempat pembelahan dan komposisi glikan. Jadi, tim secara langsung
menyelidiki apakah O-GalNAc glycans pada pembelahan S termodulasi Thr678 oleh
furin menggunakan Förster Resonance Energy Transfer (FRET) - peptida substrat
aktif sintetis. Peptida yang mencakup residu Gln 672 hingga 689 masing-masing
mengandung N-terminal 2-aminobenzoyl dan C-terminal 3-nitro-Tyr sebagai donor
fluoresensi dan bagian quencher. Peningkatan intensitas fluoresensi menunjukkan
pembelahan S yang dimediasi furin. Pertama, mereka membandingkan substrat
non-glikosilasi yang sesuai dengan lonjakan mutan WT (FRET-1) dan P681H
(FRET-2). Selain itu, mereka memasukkan TMPRSS2 rekombinan ke substrat FRET
glikopeptida FRET-1, FRET-3, dan FRET-7 ke FRET-9.
Temuan studi
Validasi komputasi dan manual mengungkapkan bahwa Thr678
membawa GalN6yne yang dimodifikasi dengan tag-I dalam sampel FL-S dan S1 hanya
dalam sel yang mengekspresikan BH-T1. Baik BH-T1 dan BH-T2 glikosilasi treonin
(Thr)323 tidak dikaitkan dengan isoenzim GalNAc-T. Analisis FRET mengungkapkan
bahwa elaborasi O--GalNAc glycans pada Thr678 dari glikoprotein SARS-CoV-2 S,
terutama dengan modifikasi bermuatan negatif, sangat menghambat aktivitas
furin. O-glikans dalam sel epitel paru-paru yang mengekspresikan GalNAc-T1
menyarankan bahwa glikosilasi adalah modifikasi signifikan secara fisiologis
yang membatasi pematangan protein S selama perjalanan evolusi.
Menurut penulis, gangguan glikosilasi O-GalNAc adalah
kekuatan pendorong utama di balik evolusi VOC SARS-CoV-2. Dalam lintasan
evolusi dari SARS-CoV-2 Alpha ke Delta dan Omicron VOCs, perubahan penting
dalam urutan AA sebelum FCS menunjukkan bahwa pembelahan proteolitik secara
bertahap ditingkatkan dengan peningkatan infektivitas VOC. Mutasi analog yang
ditemukan pada Delta VOC (P681R) yang lebih dapat ditularkan juga telah
dikaitkan dengan peningkatan pembelahan furin, menunjukkan lintasan evolusi
yang menekan O-glikosilasi sebelum meningkatkan pengenalan furin intrinsik.
Berbeda dengan P681H yang terdeteksi pada varian awal
seperti Alpha, mutasi N679K pada Omicron tidak secara substansial memengaruhi
glikosilasi tetapi menyebabkan peningkatan pembelahan furin dari peptida
sintetis. Mutasi proksimal FCS ini bertindak secara sinergis dan berevolusi
untuk menekan glikosilasi dan meningkatkan pembelahan furin.
Kesimpulan
Studi saat ini menetapkan bahwa O-glikosilasi adalah penentu
utama pembelahan dan pematangan SARS-CoV-2 S. Ini mungkin juga merupakan sisa
dari strain leluhur SARS-CoV-2 yang hilang melalui evolusi virus.
Para peneliti membuktikan bahwa GalNAc-T1 prima glikosilasi
di Thr678 dalam sel hidup. Situs glikosilasi di Thr678 dari S (tidak dekat
dengan FCS) menjelaskan mengapa residu GalNAc tunggal tidak cukup untuk
memodulasi aktivitas furin dan hanya sedikit memengaruhi aktivitas TMPRSS2.
Sebaliknya, elaborasi dan sialyation membatalkan aktivitas furin hingga 65%.
Demikian pula, O-glikosilasi berdampak negatif pada pembelahan S oleh TMPRSS2,
dengan inti 1 (Galβ1-3GalNAc-) yang mengandung O-glycans yang mengandung
disakarida memiliki efek paling besar. Secara keseluruhan, temuan penelitian
menekankan perlunya teknik penelusuran glikan yang lebih maju untuk mempelajari
evolusi SARS-CoV-2.
*Pemberitahuan Penting
bioRxiv menerbitkan laporan ilmiah awal yang tidak ditinjau
oleh rekan sejawat dan, oleh karena itu, tidak boleh dianggap sebagai
konklusif, memandu praktik klinis/perilaku yang berhubungan dengan kesehatan,
atau diperlakukan sebagai informasi yang mapan.
Journal reference:
O-Linked Sialoglycans Modulate the Proteolysis of SARS-CoV-2
Spike and Contribute to the Mutational Trajectory in Variants of Concern, Edgar
Gonzalez-Rodriguez, Mia Zol-Hanlon, Ganka Bineva-Todd, Andrea Marchesi, Mark
Skehel, Keira Mahoney, Chloe Roustan, Annabel Borg, Lucia Di Vagno, Svend
Kjaer, Antoni G. Wrobel, Donald J. Benton, Philipp Nawrath, Sabine L. Flitsch,
Dhira Joshi, Andres Manuel Gonzalez-Ramirez, Katalin A. Wilkinson, Robert J
Wilkinson, Ramon Hurtado-Guerrero, Stacy A Malaker, Benjamin Schumann, bioRxiv
preprint 2022, DOI: https://doi.org/10.1101/2022.09.15.508093,
https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2022.09.15.508093v2
No comments