Memetakan otak: Bagaimana jenis sel dan lokasi mempengaruhi penyakit Parkinson

Read Also

Dalam penelitian terbaru yang dipublikasikan di Cell Reports, para peneliti melakukan analisis transkriptom spasial sel tunggal pada ekspresi otak murine berdasarkan usia dan penyakit menggunakan model transgenik Parkinson's disease (PD), dengan fokus pada dopaminergic neurons (DA) yang mencakup 29 jenis sel.

Latar belakang

Otak yang terstruktur secara spasial mengandung berbagai sel, masing-masing dengan tujuan berbeda. PD adalah kondisi neurodegeneratif yang ditandai dengan hilangnya DA dan penumpukan alfa-sinuklein karena ekspresi berlebih melalui multiplikasi lokus.

Single-cell ribonucleic acid sequencing (RNS-seq) telah meningkatkan pengetahuan tentang ekspresi berbasis sel di organ seperti otak, namun metode saat ini gagal mencapai resolusi throughput yang tinggi. Teknologi Fluorescent in situ hybridization (FISH) memberikan sensitivitas yang lebih tinggi pada tingkat individu.

 

Tentang penelitian

Dalam penelitian ini, para peneliti melakukan profil transkriptom spasial dan translatomik DA untuk menemukan penanda sel sehat dan tua.

Para peneliti menyilangkan tikus Rosa26fsTRAP::DATIREScre (DAT-TRAP) dengan tikus SNCA-OVX untuk mengaktifkan penangkapan DA messenger RNA (mRNA) dalam model PD.

Tikus-tikus tersebut berumur hingga 18 bulan untuk menilai pengaruh ekspresi berlebih dan penuaan ⍺-synuclein manusia pada ekspresi genetik neuron dopaminergik dan mempelajari efek penuaan yang sehat dan Parkinson.

Para peneliti membuat peta transkriptomik spasial tingkat sel tunggal dari ekspresi gen di otak tikus dewasa dan profil ekspresi neuron DA tingkat translatome dengan ketelitian tinggi.

Mereka menganalisis susunan stereo-seq dengan peta transkrip khusus. Mereka mengubah peta ekspresi transkrip menjadi sel individu yang tersegmentasi, mengidentifikasi 29 jenis sel, termasuk astrosit dan neuron penghambat kortikal, di 18 irisan otak.

Tim menyaring sel-sel yang tersegmentasi berdasarkan ukuran dan kompleksitas transkriptom dan menganalisis populasi korteks, hipokampus, dan thalamus yang berbeda secara spasial. Mereka juga memeriksa otak tengah ventral dan striatum untuk memperkaya transkrip yang terbatas pada badan sel dan diduga akson.

Mereka menggunakan data dari gene enrichment dan genome-wide association studies (GWAS) untuk mengidentifikasi gen potensial penyebab penyakit.

Mereka mengevaluasi lokasi setiap sel dan membandingkan ekspresi gen saraf DA di berbagai sel.

Para peneliti memeriksa ribosom yang diberi enhanced green fluorescent protein (eGFP)-tagged dalam sel pengekspres DAT dan mengkonfirmasi kolokasi eGFP dengan tirosin hidroksilase (TH), penanda neuron DA.

Mereka memisahkan sel dari irisan otak stereo-seq, menyaringnya berdasarkan gen yang terdeteksi, dan melakukan analisis Uniform Manifold Approximation and Projection (UMAP).

Mereka juga melakukan pengurutan RNA jangka pendek dan panjang dari translating mRNA yang dikumpulkan oleh TRAP dan menggunakan pengurutan stereo dan data TRAP untuk menentukan peringkat gen prospektif untuk penyelidikan PD sporadis.

Para peneliti menunjukkan pengayaan spesifik gen penanda DA dan penipisan gen penanda tipe sel tetangga lainnya di mRNA DAT-TRAP.

Mereka mengkonfirmasi ekspresi protein calcium-sensing receptor (CASR) spesifik pada neuron otak tengah ventral tikus dan menyelidiki ekspresi CASR pada neuron DA yang berasal dari sel induk berpotensi majemuk yang diinduksi manusia. Mereka juga memeriksa variasi gen terkait usia dalam sel yang diungkapkan oleh stereo-seq.

 

Hasil

Tim mempelajari PD pada otak muda dan tua untuk mengidentifikasi gen yang memiliki ekspresi spasial yang bervariasi dalam neuron dopaminergik di ventral tegmental area (VTA) dan substantia nigra (SN) dan particular markers seperti copine-7 (Cpne7) dan Solute carrier family 10 member 4 (Slc10a4) genes.

Mereka juga mendeteksi varian sambungan yang unik untuk DA. Mereka mendemonstrasikan cara menggunakan TRAP dan pengukuran spesifisitas ekspresi sekuensing stereo untuk mengidentifikasi gen yang berpotensi relevan dari area GWAS, yang menunjukkan bahwa CASR mengatur kalsium neuronal DA intraseluler.

Temuan ini menunjukkan hilangnya neuron DA spesifik substantia nigra dan peningkatan aktivasi mikroglial seiring bertambahnya usia. Mereka menyoroti perubahan genetik terkait penuaan dan penyakit di berbagai sel, termasuk neuron dopaminergik, di banyak jalur terkait PD.

Stereo-seq mendeteksi perubahan ekspresi yang disebabkan oleh penuaan dan penyakit pada berbagai jenis sel, hilangnya neuron DA nigral, dan perluasan mikroglia neuroinflamasi.

Penelitian pengayaan jalur mengungkapkan bahwa berbagai proses biologis diubah, termasuk selubung akson, modulasi transmisi sinaptik, homeostasis ion kalsium intraseluler, dan kontrol sekresi katekolamin.

Tim tersebut mengekstraksi 355.307 transkriptom berkualitas tinggi dengan detail koordinat spasial dari 18 otak murine, mengidentifikasi total 14.494 gen.

Mereka mengamati synaptosomal-associated protein, 25kDa (Snap25) expression, dan lokalisasi terstruktur di tempat-tempat seperti thalamus atau hippocampus yang membedakan neuron dari glia.

Mereka juga memeriksa sel-sel saraf di wilayah CA1, wilayah CA3, subikulum, dan dentate gyrus di wilayah hipokampus atau gamma-aminobutyric acid (GABA)-releasing di otak tengah.

Ekspresi penanda memungkinkan identifikasi oligodendrosit, astrosit, mikroglia, dan eritrosit. Dalam sampel DAT-TRAP, penanda klasik neuron dopaminergik menunjukkan pengayaan yang signifikan, sedangkan penanda tipe sel lainnya menurun di otak tengah ventral.

 

Kesimpulan

Secara keseluruhan, penelitian ini mengidentifikasi 29 tipe sel otak unik dengan memeriksa variasi ekspresi gen spasial yang terkait dengan penuaan dan penyakit. Data stereo-seq menunjukkan perbedaan dalam penggunaan transkrip di lebih dari seribu gen.

Terdapat 817 kejadian penyambungan alternatif, yang menunjukkan bahwa lebih banyak gen yang diterjemahkan daripada yang ditunjukkan oleh data penghitungan tingkat gen. Studi ini juga menemukan penurunan jumlah sel neuron SN DA yang bergantung pada usia, yang mendukung temuan sebelumnya.

 

Journal reference:

Peter Kilfeather et al., (2024) Single-cell spatial transcriptomic and translatomic profiling of dopaminergic neurons in health, aging, and disease, Cell Reports 2024, 43, 113784, doi: https://doi.org/10.1016/j.celrep.2024.113784. https://www.cell.com/cell-reports/fulltext/S2211-1247(24)00112-8?rss=yes